Antes del experimento, todos los reactivos y muestras deben equilibrarse a temperatura ambiente; después de volver a fundir, las muestras deben centrifugarse nuevamente y tomar el sobrenadante para analizarlo; para reactivos o preparación de muestras, mezcle y evite la formación de espuma; Se recomienda calibración y muestras para pruebas duplicadas.

1. Add ple: agregue la solución de trabajo estándar a los dos primeros pocillos y agregue dos orificios para cada concentración de solución de trabajo, 100 m L de cada pocillo. Las muestras a analizar se agregan a otros pocillos, 100 m L por pocillo (para concentración de muestra por encima del rango de prueba, muestra diluida con diluciones estándar y de muestra). La microplaca se recubrió con película y se incubó a 37 ℃ durante 90 min. Consejo: Al agregar la muestra al fondo de la microplaca, trate de no tocar la pared del orificio, agite y mezcle suavemente para evitar que se generen burbujas. El tiempo adicional debe controlarse dentro de los 10 minutos.

2. Anticuerpo/antígeno biotinilado: deseche el líquido y agite para secar, sin lavar. Se agregaron inmediatamente 100 m L de solución de trabajo de anticuerpo/antígeno biotinilado a cada pocillo, se mezcló, se cubrió con una microplaca y se incubó a 37 ℃ durante 1 hora.

3. Lavado: agite el líquido en el orificio, agregue 350 m L de líquido de lavado a cada pozo, remoje durante 1-2 minutos, aspire o sacuda el líquido en la microplaca y seque sobre el papel absorbente grueso. Repita este paso de la placa de lavado 3 veces. Consejo: La lavadora se puede utilizar aquí y en otros pasos de lavado. Cada paso del lavado es esencial para el experimento.

4. Conjugado de enzima HRP: 100 μ L de solución de trabajo de conjugado enzimático por pozo, mezclada, recubierta con una película e incubada a 37 ℃ por 30 minutos.

5. Lavado: desechar el líquido en el pocillo, y lavar la placa 5 veces de la misma forma que en el paso 3.

6. Sustrato: agregue 90 μ L de solución de sustrato (TMB) a cada pocillo, mezcle bien, agregue una capa de película e incube a 37 ℃ durante unos 15 minutos. Nota: El tiempo de incubación debe acortarse o extenderse según la situación real de desarrollo del color, pero no más de 30 minutos. Se puede terminar cuando aparece un gradiente claro en el agujero estándar.

7. Terminación: Agregar 50 μ L de solución de terminación a cada pozo para terminar la reacción. Nota: el orden de adición de la solución de terminación debe ser el mismo que el de la solución de sustrato.

8. Leer: Mida inmediatamente la densidad óptica (OD) de cada pocillo a 450 nm con un lector de microplacas. El lector de microplacas debe abrirse con anticipación para configurar el procedimiento de prueba.

9. Después del experimento, vuelva a colocar el reactivo no utilizado en el refrigerador de acuerdo con la temperatura de almacenamiento especificada hasta la vida útil.